摘要：目的 探討藁本內酯抗人肺癌A549細胞增殖的作用機制。方法 CCK-8法檢測藁本內酯對A549細胞活力的影響，TUNEL法檢測細胞凋亡率，Hoechst 33258熒光染色法觀察A549細胞的形態變化，ELISA檢測血管內皮生長因子(VEGF)含量，Western blot檢測核因子-κB(NF-κB)、Bcl-2、Bax及磷酸化JNK蛋白表達。結果 15、30、60、120、180 μmol/L藁本內酯作用12、24、48 h能抑制A549細胞活力(P<0.05，P<0.01， P<0.001)，并呈劑量及時間依賴(P<0.05，P<0.01);30、60、120 μmol/L藁本內酯作用12、24、48 h，細胞凋亡率呈時間和劑量依賴(P<0.05，P<0.01);經藁本內酯處理48 h后，A549細胞核可見明顯凋亡形態，包括核皺縮、碎裂、亮藍色熒光，染色質分割產生凋亡小體;30、60、120 μmol/L藁本內酯細胞核內NF-κB蛋白p65亞基表達升高、細胞內JNK蛋白磷酸化水平升高、抑凋亡蛋白Bcl-2表達降低及促凋亡蛋白Bax表達升高(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。結論 藁本內酯通過抑制VEGF的表達而抑制腫瘤新生血管的形成，通過調控NF-κB蛋白表達及JNK蛋白磷酸化水平，降低Bcl-2/Bax比值，誘導腫瘤細胞凋亡。

　　關鍵詞：藁本內酯;A549細胞;凋亡;血管內皮生長因子;核因子-κB

　　藁本內酯是當歸、川芎等中藥中主要活性成分之一，對心腦血管、循環系統及免疫功能均有較強的藥理作用[1-2]。研究表明，藁本內酯具有抗腫瘤活性，能夠誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的增殖、轉移及腫瘤的生長、浸潤[3-5]。本研究以肺腺癌A549細胞為模型，觀察藁本內酯誘導A549細胞凋亡的影響，并探討其作用機制，以期為臨床藁本內酯治療肺癌提供實驗數據。

　　1 材料與方法

　　1.1 藥物與細胞

　　藁本內酯，天津士蘭科技有限公司，純度>98%;A549細胞購自ATCC。

　　1.2 主要試劑與儀器

　　CCK-8試劑盒，上海博谷生物科技有限公司;蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、TUNEL試劑盒及人血管內皮生長因子(VEGF)ELISA試劑盒，Roche公司;Hoechst 33258試劑盒，上海依科賽生物制品有限公司;細胞核和胞質蛋白提取試劑盒，生工生物工程上海(股份)有限公司;DMSO及胎牛血清(FBS)，Gibco公司;兔抗人核因子-κB(NF-κB)、磷酸化-JNK(P-JNK)、Bcl-2及Bax抗體，Santa Cruz公司。熒光顯微鏡IX51(日本Olympus公司)，ELx800酶標儀(美國BioTek公司)，Z-323高速低溫離心機(德國HERMLE公司)，FCM流式細胞儀(美國BD)。

　　1.3 細胞培養

　　A549細胞在含10%胎牛血清和青霉素100 μg/L、鏈霉素100 μg/L的DMEM培養基中，37 ℃、5%CO2孵育。細胞貼壁生長，2～3 d傳代1次。細胞生長至對數期時開始實驗，待細胞生長至80%時，serum- starved 10 h后用于實驗。

　　1.4 CCK-8法檢測細胞活力

　　取對數生長期細胞，37 ℃預熱，PBS洗3次， 0.25%胰酶消化，制成細胞懸液，以100 μL/孔(6000 cells)接種在在96孔板中，37 ℃、5%CO2培養箱中預培養，待細胞生長至80%時，serum-starved 10 h。給予含藁本內酯15、30、60、120、180 μmol/L的無血清培養基，繼續培養12、24、48 h，溶劑對照給予稀釋倍數與最大藥物濃度相同的DMSO(下同)。除去含藥/溶劑培養基，并用新鮮培養基洗滌細胞2次，加入新的培養基，每孔加入10 μL CCK-8溶液。將培養板在培養箱內孵育4 h后用酶標儀測定450 nm處的吸光度(OD值)。

　　1.5 TUNEL法檢測細胞凋亡率

　　取對數生長期細胞，以2 mL/孔(3×105 cells)接種在6孔板中，37 ℃、5%CO2培養箱中預培養，待細胞生長至80%時，serum-starved 10 h。實驗組給予藁本內酯30、60、120 μmol/L，繼續培養12、24、48 h。1500 r/min離心5 min，收集細胞，用4%多聚甲醛固定細胞，置水平搖床上緩慢搖動30～60 min，重懸細胞，然后根據TUNEL試劑盒說明書采用流式細胞儀進行檢測。

　　1.6 Hoechst 33258熒光染色法檢測細胞核形態

　　細胞接種同“1.3”項。6孔板中置大小合適滅菌的載玻片。serum-starved 10 h后，實驗組分別給予30、60、120 μmol/L藁本內酯，繼續培養48 h。棄去培養液，用4%多聚甲醛在4 ℃條件下固定15 min，棄固定液養液，Hoechst 33258染色液室溫條件下染色15 min。鏡檢。

　　1.7 ELISA檢測血管內皮生長因子含量

　　細胞接種同“1.3”項。取對數生長期細胞，以2 mL/孔(3×105 cells)接種在6孔板中，37 ℃、5%CO2培養箱中預培養，待細胞生長至80%時，serum- starved 10 h。實驗組給予含藁本內酯30、60、120 μmol/L的無血清培養基，繼續培養48 h。取培養液，1000 r/min離心5 min，除去細胞碎片及顆粒物，收集上清。根據VEGF試劑盒說明書進行操作。

　　1.8 Western blot檢測核因子-κB、磷酸化JNK、Bcl-2及Bax蛋白表達

　　按“1.3”項步驟收集細胞培養液，冰浴的PBS洗1遍，用細胞刮子刮下細胞，1000 r/min離心5 min，收集細胞沉淀，分別提取總蛋白和細胞核蛋白。在細胞沉淀中加入適量裂解液(含蛋白酶或磷酸酶抑制劑)，冰浴裂解30 min，每隔10 min高速渦旋15 s。4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清，BCA法測定樣品中總蛋白濃度;用細胞核蛋白抽提試劑盒，根據說明書提取細胞核蛋白。上樣量為40 μg。一抗(兔抗人NF-κB(p65)、P-JNK、Bcl-2、Bax均按1∶1000稀釋)4 ℃過夜，二抗(1∶10 000稀釋)37 ℃孵育2 h， ECL法顯色。采用軟件Image pro plus 6.0分析條帶的積分光密度。

　　1.9 統計學方法

　　采用SPSS16.0統計軟件進行分析。實驗數據以─x±s表示，結果中“2.1”“2.2”項采用雙因素分析，其余數據進行單因素分析及LSD-t組間檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

　　2 結果

　　2.1 藁本內酯對A549細胞活力的影響

　　與溶劑對照組比較，予藁本內酯孵育12、24、48 h后，細胞活力均明顯下降(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，說明藁本內酯能夠抑制A549細胞的增殖，其IC50分別為121.98、89.99、62.70 μmol/L。藁本內酯對A549細胞的抑制作用呈時間和濃度依賴性(P<0.05，P<0.01)，兩者之間無交互作用(P>0.05)。結果見表1。